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菌种为什么会衰退?常见菌种衰退原因及预防措施

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微生物长期受到外界的影响,遗传性状必然发生某些变异。正是由于变异的存在才使得生物向前进化。然而由于突变的存在,菌种在培养或保藏过程中,可能会出现某些优良生产性状的劣化、遗传标记丢失、典型特征改变等现象,称为菌种衰退。比如苏云金芽孢杆菌由于菌种衰退,导致其新生的菌体芽孢和伴孢晶体都比较小;保藏的沙门氏菌鞭毛抗原丢失,导致H多价血清不凝固等。

01



菌种衰退原因

菌种衰退的根本原因是有关基因的负突变。如果控制产量的基因发生负突变,则表现为产量下降;如果控制孢子生成的基因发生负突变,则产生孢子的能力下降。菌种在移种传代过程中会发生自发突变。虽然自发突变的几率很低(一般为10-6~10-9),尤其是对于某一特定基因来说,突变频率更低。但是由于微生物具有极高的代谢繁殖能力,随着传代次数增加,衰退细胞的数目就会不断增加,在数量上逐渐占优势,最终成为一株衰退了的菌株。此外,菌种衰退还有以下几种原因:

 

1、表型延迟造成菌种衰退

表型延迟现象也会造成菌种衰退。如,在诱变育种过程中,经常会发现某菌株初筛时产量较高,进行复筛时产量却下降了。

 

2、质粒脱落导致菌种衰退

质粒脱落导致菌种衰退的情况在抗生素生产中较多,不少抗生素的合成是受质粒控制的。当菌株细胞由于自发突变或外界条件影响(如高温),致使控制产量的质粒脱落或者核内DNA和质粒复制不一致,即DNA复制速度超过质粒,经多次传代后,某些细胞中就不具有对产量起决定作用的质粒,这类细胞数量不断提高达到优势,则菌种表现为衰退。

 

3、连续传代

连续传代是加速菌种衰退的一个重要原因。一方面,传代次数越多,发生自发突变(尤其是负突变)的几率越高;另一方面,传代次数越多,群体中个别的衰退型细胞数量增加并占据优势越快,致使群体表型出现衰退。

 

4、不适宜的培养和保藏条件

不适宜的培养和保藏条件是加速菌种衰退的另一个重要原因。不良的培养条件如营养成分、温度、湿度、pH值、通气量等和保藏条件如营养、含水量、温度、氧气等,不仅会诱发衰退型细胞的出现,还会促进衰退细胞迅速繁殖,在数量上大大超过正常细胞,造成菌种衰退。

 

02



防止菌种衰退措施

采用已衰退菌种进行生产会影响生产效率,而把已衰退菌种作为阳性菌株进行检验,则会影响检验正确率。既然变异是不可避免的,那么我们应该如果避免菌种衰退呢?

 

1、控制传代次数

尽量避免不必要的移种和传代,把必要的传代减少到最低的水平以减少突变几率。传代次数越多,产生突变的几率就越大,菌种发生衰退的机会就越高。在实验室检验或者是生产实际中,应严格控制传代次数。中国药典当中规定,培养基灵敏度检查所用的菌株传代次数不得超过5代,以防止菌株因传代次数过多引起衰退影响检验。

 

2、利用不同类型细胞进行接种传代

放线菌,霉菌用菌丝进行移种比分生孢子容易衰退,因菌丝是对核且有异核存在,所以移种霉菌适宜采用孢子。

 

3、良好的培养条件

不良的培养条件会衰退细胞的出现,因此采用适宜的培养基进行菌种培养,以减少衰退几率

 

4、采用有效的菌种保藏方法

根据保存时间的长短,选择适宜的保存方法。

 

·传代培养法:复苏后的第一代放于4℃冰箱或室温保存,定期传代培养。保藏时间依微生物种类而定。如,芽孢、霉菌、酵母菌保存6个月转一次,普通细菌1个月转一次,假单胞菌2周转一次

 

·甘油冻存法:将复活后经过性能确认的菌株新鲜培养物(一般是第二代菌株),用0.85%的灭菌生理盐水(约1-2ml)洗斜面菌苔成菌悬液;将上述菌悬液吸取适量于灭菌管(冻存管)中(如,灭菌管容量为5ml,则取1.5ml菌液),加入等体积的40%灭菌甘油,混匀,密封。保藏温度为—20℃,一般可保存1-2年。

 

·瓷珠保存管保存:菌株保藏管内含特制的小珠(20-25颗)和特殊溶液,只需将培养好的菌株接入溶液中,摇匀成菌悬液,细胞即吸附于小珠上,然后吸出溶液,将保藏管置-70℃可保存5年,置-20℃可保存2-3年。

 

 

小贴士







瓷珠保存管保存具体操作:

第一步:对需要保存的菌株进行必要的纯化,挑取生长旺盛时期的菌落,接入菌株

保藏管中,通常需要接入4-7环,对于苛养菌应多接一些;

第二步:拧上盖子,充分剧烈震荡;

第三步:用无菌吸管将溶液吸走,尽可能吸干;

第四步:马上放入冰箱中,温度越低越有利于保存(推荐使用-70℃超低温冰箱);

第五步:复苏时,只需将小珠在平板上滚动或置肉汤中培养。

 

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